聚焦一流 创新引领│2022年度广西科技进步奖励获奖项目系列报道之四
探明和利用甘蔗联合固氮规律 促进甘蔗生产减肥增效
——记2022年度广西自然科学奖二等奖“甘蔗联合固氮研究与应用”
从2023年广西科学技术奖励大会上获悉，我院牵头完成的“甘蔗联合固氮研究与应用”项目荣获2022年自然科学奖二等奖。
甘蔗是世界上重要的糖料和能源作物。广西是中国最大产蔗区，甘蔗产量和蔗糖产量占全国60%以上，但生产中氮肥用量大，一般每公顷施氮量450-750 kg，约是巴西平均施氮量的8-10倍，世界平均施氮肥量的2倍以上，此外，氮肥利用率低（仅14.5-24.7%），大部分氮被挥发、淋溶和土壤吸附，蔗田损失的氮素已成为重要的面源污染因素，严重制约我国甘蔗生产的可持续发展。
甘蔗能通过与固氮菌联合固氮获得氮素，研究显示甘蔗中30%-60%氮素可来源于生物固氮，巴西甘蔗生产在施少量氮肥的同时，却能保持连年高产且土壤肥力不减，正是得益于对甘蔗联合固氮的有效利用。我国甘蔗是否普遍存在生物固氮，表现如何？有哪些固氮菌起作用？其多样性如何？固氮菌作用机制和效果如何？在生产上如何应用？都不清楚。
针对上述问题，广西农业科学院李杨瑞教授带领团队成员，联合广西大学、浙江大学等相关单位科技人员，经过20多年的研究，取得了一系列重要创新性成果。
探明并利用甘蔗全生长期固氮规律，助力于甘蔗生产减肥增效
基于固氮菌在不同生态环境下的固氮水平与固氮酶铁蛋白基因nifH的表达水平相符，项目组先后用15N同位素稀释法、乙炔还原法、免疫印迹法、RT-PCR、qRT-PCR等方法检测发现我国种植的甘蔗根、茎、叶中普遍存在联合固氮特性；甘蔗不同品种、不同器官中表达nifH的固氮菌种类多样性丰富。发现甘蔗联合固氮活性在苗期较弱，随生长而增强，在伸长期最强，不同品种间差异显著；苗期适量施氮肥显著促进蔗株生长，伸长期不施氮可诱导甘蔗高效联合固氮，而伸长期大量施氮肥严重抑制甘蔗联合固氮。
基于甘蔗全生长期的固氮规律，项目组改进了甘蔗施肥方法，创建了诱导甘蔗增强联合固氮的栽培新技术，该方法只在甘蔗生长早期一次性施用适量氮肥，并加强水分及田间管理，攻苗、攻蘖促长，以快速形成合理群体；中期保水控氮，诱导甘蔗联合固氮。通过应用这一技术，配合种植氮高效利用甘蔗品种以及甘蔗和制糖生产中的废弃物（蔗叶、滤泥、酒精发酵液等）资源化利用还田，可在保证高产稳产的基础上，降低氮肥使用量75%，提高蔗糖分0.58%（绝对值）。该技术近3年应用面积达2194万亩，合计减施氮素65.82万吨，节本42.85亿元；多产糖57.26万吨，增加糖厂效益31.49亿元，产生了巨大的社会经济效益和生态效益。
创建甘蔗联合固氮菌资源库，为固氮菌的资源化利用提供基础
项目组先后从50多个甘蔗种植区采集不同甘蔗品种植株和根际土壤样品，通过“菌株分离物→无氮培养筛选→扩增固氮酶基因→乙炔还原乙烯活性→固氮菌”的方式，发现在甘蔗体内表达nifH基因的固氮菌大多数可以分离培养，共分离筛选到1200多个固氮菌株，创建了我国唯一的甘蔗联合固氮菌资源库。通过菌株16S rRNA、nifH序列鉴定分类到4个门41个属。先后测定了18个高效甘蔗联合固氮菌株的全基因组序列，用基因组学分类法鉴定了一个分类新种—甘蔗肠杆菌（Enterobacter sacchari）。探明了不同氮水平、温度、pH值等显著影响固氮菌生长和固氮酶活性的理化因素，并发现不同土壤生态条件、栽培模式显著影响甘蔗内生固氮菌多样性。项目组研究还表明，除固氮作用外，大多数固氮菌株还具有两种以上其它促植物生长功能，如分泌生长素、抗生素和嗜铁素，溶磷、解钾、ACC脱氨酶活性、拮抗病原微生物、降解农药等促植物生长功能，为固氮菌的资源化利用提供了充足的菌株资源。
甘蔗固氮菌的形态鉴定
物生长功能鉴定
探明内生固氮菌定殖甘蔗的方式，揭示了固氮菌促进甘蔗生长的生理机制
项目组通过将绿色荧光蛋白标记的质粒导入固氮菌株，接种到甘蔗组培苗，然后用荧光显微镜观察固氮菌在甘蔗根部的侵染和定殖状况，通过激光扫描共聚焦显微镜对固氮菌定殖位点进行活体无损伤的光学扫描成像，发现固氮菌主要从根表面侧根位点侵入根皮层组织内，部分固氮菌还能进入根毛内；进入根木质部导管的固氮菌可沿导管随蒸腾流迁移到地上部分，在叶表面的固氮菌也可从气孔进入叶细胞间隙；固氮菌主要定殖在根毛区和根伸长区表面的根缘细胞周围、根皮层的细胞间隙和细胞内及木质部导管内；此外，叶表皮细胞内、叶肉细胞间隙和叶维管束内也有固氮菌定殖。项目组研究还发现甘蔗内生固氮菌产生的多糖酶能降解果胶、纤维二糖、木聚糖等植物细胞壁成分，可以促进固氮菌系统侵染定殖甘蔗。
甘蔗固氮菌侵染定殖甘蔗模式测定
通过15N同位素稀释法，项目组首次发现Kosakonia属、Raoultella属、Klebsiella属固氮菌与甘蔗联合固氮，显著提高甘蔗植株的生物量，并增强甘蔗根系活力，促进根对矿质元素的吸收，增强叶片的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率，提高叶绿素含量；提高甘蔗叶片的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性，促进叶片中硝态氮的积累，调节氮代谢水平，促进甘蔗生长，提高产量。项目组研究还发现固氮菌中生成的2, 3-丁二醇脱氢酶，通过与甘蔗互作，催化乙偶姻还原为2, 3-丁二醇，进而调节甘蔗内源植物激素变化，促进细胞伸长和叶绿素合成，提高光合效率，促进蔗株生长。
开创甘蔗生物固氮育种新方向，促进甘蔗联合固氮特性利用
针对氮肥过量施用导致甘蔗栽培品种长期处于氮胁迫下无法形成高效的联合固氮系统的问题，项目组应用叶片死亡数，功能叶数、叶色、植株拔节比率、株高等形态性状指标，建立低氮胁迫选择指数，先后对400多份甘蔗种质进行低氮胁迫试验，先后筛选出桂糖29号、桂糖21号、崖城58-47、崖城62-40、湛蔗74-141等40个耐低氮能力较强的甘蔗品种。
基于不同基因型甘蔗联合固氮特性差异，开展固氮能力强的优良甘蔗亲本筛选和配合力测试，选配优良组合，开展杂交育种，每年80−100个组合，约2万实生苗。实生苗和后续材料均在低氮胁迫下（实生苗及早期选育阶段不施氮，中后选育阶段施氮量相当于正常施氮水平的0%−25%）进行筛选，得到了ROC5×F69-463、FR99-49×粤甘18、桂糖05-3661×桂糖02-827、福农02-6427×ROC22等30个高固氮能力和耐低氮胁迫的优良组合，建立了一个固氮甘蔗品种选育体系，选育出一批固氮能力强的氮高效利用优良甘蔗品种（系），为促进甘蔗联合固氮特性利用，甘蔗生产减肥增效提供了品种资源。
具有高效联合固氮能力甘蔗种质的筛选利用
团队简介：
甘蔗生物固氮研究团队，主要开展甘蔗固氮菌资源的多样性分析、优势固氮菌和高固氮甘蔗种质资源挖掘利用、高效联合固氮体系的建立及其调控机理等方面的研究，是国内开展甘蔗生物固氮研究时间最早、持续时间最长的团队。20多年来，团队先后获得14项国家自然科学基金，国家863计划、广西八桂学者、广西创新团队、特聘专家等科研项目50多项，先后出版专著6部，发表论文104篇（其中SCI收录32篇），授权发明专利6件（美国发明专利1件），实用新型专利36件，软件著作权48项，先后培养了博士后11名、博士生12名，硕士生30名。
甘蔗所 李长宁供稿/供图
一审一校：吴建明
二审二校：薛臣艺
三审三校：杨景峰
